编者按

 I型CRISPR-Cas系统广泛存在，在原核生物基因组编辑和基因调控方面表现出高通用性和高效率。然而，由于其多亚基组成和大尺寸，其在真核生物中的应用尚未得到深入的研究。

2024年8月23日，中国科学院微生物研究所向华团队在国际期刊《自然·通讯》（Nature Communications）上发表了题为《工程化最小I型 CRISPR-Cas 实现人类细胞的转录激活和碱基编辑》的最新研究成果，成功应用Class 1中最精简的I-F2型系统在人类细胞中实现了高效基因调控，并创新性地开发了具有宽编辑窗口的碱基编辑工具。

该研究证明了I型-F2级联，I型系统中最紧凑的，总基因大小小于SpCas9，可以被开发用于人类细胞的转录激活。工程I-F2工具的效率可以匹配或超过dCas9。此外，使用I-F2级联创建了一个碱基编辑器，引入了一个相当宽的双峰分布的编辑窗口(~30 nt)。它可以扩展目标位点，这对破坏功能序列和基因筛选是有用的。

文章题目

Engineered minimal type I CRISPR-Cas system for transcriptional activation and base editing in human cells

杂志：Nature Communications（IF=16.6）

发表时间：2024年8月23日

作者：郭京、龚路遥、禹海英、向华等

单位：中国科学院微生物研究所等

01、研究背景

CRISPR-Cas系统是一种广泛分布于原核生物中的适应性免疫系统，可分为两类、六种类型和30多个亚型。第1类包括I型、III型和IV型，其效应模块由多种蛋白质组成；第2类包括II型、V型和VI型，其特征是单一的多结构域效应蛋白。CRISPR免疫机制通常涉及适应、crRNA生物发生和干扰三个过程。

I型系统是最常见的CRISPR-Cas类型，分为I-A到I-G等7个亚型。I型的crRNA结合复合物被称为Cascade（用于抗病毒防御的CRISPR相关复合物），它与crRNA相结合进行靶标识别，促进crRNA及其互补的靶DNA的双重形成以构建R环，并招募Cas3核酸酶从而过程性降解DNA。I型系统已被开发成各种微生物基因组操作工具，如具有同源修复模板的基因组编辑工具、转录调控工具、大片段删除工具、不需要同源重组的大片段整合工具，及使用Cascade-Cas3进行基因组编辑和基因调控的工具。

自2019年以来，多个I型亚型已成功用于真核生物基因组操作。当Cascade和Cas3同时表达时，Cas3表现出外切酶活性，导致多达200kb的大片段缺失。I-D型也报告了类似的活性，其中Cas10是一种功能性核酸酶，同时检测到了短核苷酸。Cas3 与胞苷脱氨酶 (CDA) 的融合可以实现广泛的随机诱变，覆盖范围多达55kb，这为优化复杂的生物合成途径提供了有效的工具。

此外，Cascade可以与不同的域融合以实现不同的功能。当Cascade与依赖于二聚化的非特异性FokI核酸酶域结构域融合时，其编辑效率与dCas9-FokI相当；当Cascade与转录激活或抑制域融合时，可以调节目标内源基因的表达水平。

然而，真核生物中的Cascades由包括Cas6的4-5个亚基组成，Cas6将crRNA前体（pre-crRNA）加工成成熟的crRNA。如，大肠杆菌（Escherichia coli）K12型I-E级联系统的Cascade由5个亚基组成，总基因大小约为4.4 kb。乳糖奈瑟球菌ATCC 23970型I-C级联系统的Cascade由4个亚基组成，总基因大小为约3.8 kb，包括隐藏的小亚基在内。大基因尺寸阻碍了在载荷尺寸受限的应用中的应用，例如广泛应用的腺相关病毒（AAV）载体，其包装限值约为4.7 kb，这阻碍了大多数CRISPR工具的临床应用。因此，挖掘更紧凑的I型系统将有助于将I型基因组操作工具应用于真核生物。

另一方面，R环的形成是CRISPR系统的一个重要特征。在R环结构中，被crRNA间隔器移位的非靶标DNA链被暴露并可供其他分子访问，这被碱基编辑技术所利用。通过将单链DNA（ssDNA）脱氨酶或糖基化酶融合，并与催化能力受损的Cas核酸酶再融合，碱基编辑器可以在不需要双链DNA（dsDNA）断裂或供体DNA模板的情况下进行各种碱基转换。然而，碱基编辑器主要是在催化能力受损的Cas9或Cas12的基础上开发的。

值得注意的是，与Cas9或Cas12相比，I型系统形成的R环要宽得多，跨度约为30-40个核苷酸，而Cas9或Cas12的R环要窄得多，约为20个核苷酸。I型系统中的这种扩展的R环可能为ssDNA脱氨酶或糖基化酶提供更多的核苷酸底物，从而扩展靶向位点。因此，探索I型系统在碱基编辑中的潜力，对于开发具有广泛编辑窗口的碱基编辑器可能是有价值的。

在这项研究中，研究人员探究了紧凑型I-F2系统在人体细胞中的应用。I-F2型系统具有迄今为止已识别的最紧凑级联，其由Cas5、Cas6和Cas7组成，没有大亚基(Cas8)或小亚基(Cas11)，其总基因大小显著小于SpCas9，使其成为更易于在真核生物中传递的候选基因。然而，之前将该系统应用于真核生物的尝试均未成功。

在这里，研究人员提出了一个紧凑的I-F2型系统来操纵人类基因组。该级联源自Mos350，总基因大小约2.7 kb，优选简单的5'-CC原间隔区相邻基序（PAM）。通过将转录激活域与Cascade融合，可以调节人类细胞中的基因表达，并通过crRNA和Cascade工程实现强大的活性。此外，通过将脱氧腺苷脱氨酶与级联酶融合，研究人员开发了一种具有I-F2系统的基础编辑器。有趣的是，这种腺嘌呤基编辑器（ABE）引入了一个宽的编辑窗口（~30 nt），具有双峰分布，并且可以实现超过50%的编辑效率。具有宽编辑窗口的I-F2 ABE可用于基因筛选和干扰功能序列，这些结果突出了紧凑型I-F2系统在真核生物中的潜力，并扩展了基础编辑工具箱。

图1  Class 1最精简I-F2型CRISPR-Cas系统

02、研究成果

1、首次获得在真核细胞中有活性的精简I-F2型系统并成功构建CRISPRa工具

通过生物信息学分析，向华团队在数据库中找到93个不同菌种来源的I-F2型CRISPR-Cas系统。这极大地扩充了这类系统的基因资源，为其应用提供更多选择。其中11个不同来源的I-F2型CRISPR-Cas系统被合成并在人类细胞中测试其功能。最终，他们发现来自奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis CCUG 350，Mos350)的I-F2型系统在真核细胞中可以表现出较好的活性。通过在该系统的Cas7蛋白上融合VPR转录激活因子，可实现多个基因的表达上调。

图2.  基于精简的I-F2型系统开发CRISPRa工具

2、通过crRNA和蛋白工程化改造，实现了I-F2 CRISPRa工具更高效的转录激活

在I型CRISPR-Cas系统中，通常crRNA的间隔序列(spacer)长度每增加6 nt，就会有一个额外的Cas7亚基参与Cascade复合物的组成。因此，该团队通过延长spacer来增加Cascade中Cas7-VPR融合蛋白的拷贝数，结果检测到了更高的基因转录水平。

接着，通过分析Cascade-crRNA-DNA三元复合物的结构信息，将Mos350 Cas7蛋白中第175位亮氨酸(L)替换成含有芳香残基的苯丙氨酸(F)来增强Cas7与核酸之间的堆积作用力，结果提升了靶标DNA-crRNA杂交双链的稳定性，进一步提高了转录激活效果。工程化改造后的I-F2 CRISPRa工具可以与dCas9-VPR工具效果相当，在个别靶点效果甚至更好且脱靶效应更低。

图3.  通过crRNA和蛋白工程化改造提升I-F2 CRISPRa激活水平

3、在I型Cascade中融合腺嘌呤脱氨酶TadA-8e，获得了具有独特宽编辑窗口的I-F2 ABE碱基编辑工具

传统的碱基编辑工具利用催化活性受损的Cas9或Cas12融合脱氨酶。Cas9或Cas12形成的R-loop约20 nt，最终得到较小的编辑窗口(通常小于10 nt)，限制了碱基编辑工具的应用范围。I型系统可以形成比Cas9或Cas12宽许多的R-loop(约30 nt)，推测其可能形成独特的编辑窗口。

实验结果表明，I-F2 ABE能形成约30 nt的宽编辑窗口，且呈现双峰特征，在第9位和第27位碱基附近编辑效率达到峰值。该工具在基因组中具有普遍的碱基编辑活性，编辑效率可超过50%，并且在疾病治疗相关位点也表现出了应用潜力。

图4.  I-F2 ABE碱基编辑工具具有独特宽编辑窗口

研究表明，通过融合不同的结构域，I-F2型Mos350 Cascade可以在人类细胞中实现高效的转录激活或宽窗口的碱基编辑。Mos350 Cascade基因之和约2.7 kb，远小于SpCas9(约4.1kb)，仅由3种亚基(Cas5、Cas6和Cas7)组成。基于该系统开发的工具有望实现单个AAV递送。其中Cas6可以加工前体crRNA，易于实现多位点的同时靶向。

在转录调控方面，基于I型系统的强可塑性，可以通过改变spacer长度实现不同转录水平的精细调控。在碱基编辑方面，I-F2 ABE能产生独特的宽编辑窗口，因此具有更多的可靶向位点，并能诱导更多的突变类型。宽编辑窗口适用于破坏功能序列，如破坏感染相关基因或抑制基因用于遗传病治疗。

此外，宽编辑窗口还适用于作物育种中重要基因的原位饱和诱变与多重碱基编辑。这项研究突出了精简的I型系统在真核生物中的应用潜力，尤其是具有宽编辑窗口的碱基编辑工具。而I型系统的多亚基结构，还有望为开发更多新颖性的基因操作工具提供底层平台。

图5.  I-F2型系统可提供多样性基因操作工具底层平台

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